人源肾细胞(HEK293T)蛋白LGALS1真核表达载体的构建OA

目的:扩增LGALS1、ZFP36L2、WBSCR22三种蛋白的基因,构建其真核表达载体,为后续蛋白互作、毒力因子分析等实验奠定基础.方法:根据毒力蛋白基因序列,使用premier 5.0软件设计了三对特异性引物用于基因扩增.以HEK293T细胞中提取出的RNA反转录出的cDNA为模板,PCR法扩增三种基因LGALS1、ZFP36L2、WBSCR22,连接至pMD19—T载体,构建出 pMD19—T—LGALS1、ZFP36L2、WBSCR22,分别经 Nde Ⅰ和 BamH Ⅰ,EcoR Ⅰ和 NdeⅠ,BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后连接到pGBKT7真核表达载体中,构建出pGBKT7—LGALS1、pGBKT7—ZFP36L2、pGBKT7-WBSCR22.结果:目的基因 LGALS1、ZFP36L2、WBSCR22扩增成功,pMD19—T-LGALS1、pMD19—T—ZFP36L2、pMD19-T—WBSCR22连接成功,双酶切成功,真核表达载体pGBKT7-LGALS1构建成功,pGBKT7—ZFP36L2、pGBKT7—WBSCR22构建失败.结论:真核表达载体pGBKT7—LGALS1成功构建,为后续实验的进行提供了便利.pGBKT7—ZFP36L2、pGBKT7—WBSCR22构建失败,积累了丰厚的实验经验.