基于跨反向剪接位点引物特异性检测circRNA的PCR方法OA北大核心CSCDCSTPCD

为了特异扩增circRNA发生可变反向剪接环化事件时被包含的circRNA,准确分析目标circRNA的表达水平。首先通过生物信息学分析葡萄高可信度circRNA的可变反向剪接环化事件特征,提出一种适用于葡萄circRNA可变反向剪接环化事件的引物设计改良方法,即一端引物的3''端跨反向剪接位点3-4个碱基,并运用RT-PCR和qRT-PCR方法进行验证。结果表明,高可信度葡萄circRNA的来源基因中有21.7%存在可变反向剪接环化事件,可分为并列、交叉和包含关系。选取4组circRNA进行扩增,其中circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086分别被circRNA_4364、circRNA_6018、circRNA_6045和circRNA_7085包含,使用常规背向引物对被包含的4个circRNA进行RT-PCR可获得2条扩增条带,且qRT-PCR溶解曲线为双峰。通过应用改良引物对circRNA_4363、circRNA_6017和circRNA_7086进行RT-PCR和qRT-PCR可获得单一扩增产物。相较于常规背向引物,使用改良引物可以特异扩增发生可变反向剪接环化事件时被包含的circRNA,使其定量分析结果更加准确可靠。