橡胶树膜系统酵母双杂交cDNA文库构建及HbSRPP7互作蛋白筛选OACSCDCSTPCD

橡胶树橡胶粒子上的蛋白质在橡胶生物合成一系列反应过程中起着关键作用,它们直接决定着橡胶烃分子的数量和大小,影响天然橡胶的产量和质量.小橡胶粒子蛋白(small rubber particle protein,SRPP)是丰度仅次于橡胶延伸因子(rubber elongation factor,REF)的橡胶粒子蛋白组分,与橡胶粒子发育和橡胶生物合成密切相关.目前已知橡胶粒子上存在多种SRPP家族蛋白,但大部分成员的功能尚不清楚.SRPP可能通过与其他橡胶粒子蛋白相互作用发挥功能.为了筛选 SRPP 蛋白家族成员之一 HbSRPP7 的互作蛋白,本研究利用位点特异性重组技术构建了原始库容为1.5×107 CFU的均一化橡胶树胶乳膜蛋白酵母双杂交系统(membrane yeast two-hybrid system,MYTH)cDNA文库,该文库插入片段平均长度大于 1500 bp,重组率约为 100%.构建了用于 MYTH 系统筛选 HbSRPP7 互作蛋白的pBT3STE-SRPP7 和 pBT3SUC-SRPP7 诱饵载体并确认其能在 NMY32 酵母菌株中正确表达,无自激活活性.使用pBT3STE-SRPP7 诱饵质粒对胶乳MYTH cDNA文库进行筛选,获得 21 个HbSRPP7 候选互作的蛋白,包括 3 个REF家族蛋白(HbREF1、HbREF3 和 HbREF8)、2 个 SRPP 家族蛋白(HbSRPP1、HbSRPP2)、2 个活性氧清除相关蛋白(thioredoxin H-type-like、L-ascorbate peroxidase 2)以及 5 个胁迫相关蛋白(high mobility group B protein 2-like、RPM1-interacting protein 4-like、stress-related protein-like、salt stress-induced hydrophobic peptide ESI3-like和F-box/kelch-repeat protein).结果显示HbSRPP7 除了可能通过与橡胶生物合成相关的橡胶粒子蛋白互作参与橡胶生物合成,也可能通过与生物和非生物逆境胁迫相关蛋白互作,响应橡胶树乳管生物和非生物逆境胁迫系统信号,参与橡胶粒子上的橡胶生物合成调控.该研究结果有助于了解 SRPP 家族蛋白的功能,为揭示橡胶粒子上参与橡胶生物合成的蛋白复合体组成,阐明橡胶生物合成及其调控的分子机制奠定基础.