盐碱胁迫诱导的猴樟酵母cDNA文库构建及CbP5CS上游调控因子筛选OACSCDCSTPCD

盐碱土壤环境是限制猴樟引种推广的主要因素,脯氨酸是植物适应盐碱胁迫过程中主要的渗透调节物质,筛选并鉴定出调控脯氨酸合成的转录因子对于猴樟耐盐碱分子机理研究具有重要意义.以猴樟实生苗为材料,在水培培养基础上,采用0 mmol/L和 10 mmol/L的Na2CO3 溶液分别进行处理,选取处理 6 h、48 h的根系组织,提取总RNA,构建盐碱胁迫诱导的猴樟根系酵母cDNA文库;以猴樟根系总DNA为模板,克隆CbP5CS启动子序列,采用Y1H酵母单杂交技术筛选出与CbP5CS启动子存在互作的蛋白,并通过高通量测序技术鉴定出调控猴樟脯氨酸合成的转录因子.结果表明,所构建的cDNA文库库容为 4.88×107 CFU/mL,总克隆数为 9.76×107 CFU,文库插入片段平均长度在 1 000 bp左右,cDNA片段重组率为 100%,符合酵母杂交试验的要求.克隆出的CbP5CS启动子序列长 2 012 bp,成功构建出诱饵质粒pHIS2-CbP5CS,利用共转化方法从文库中筛选到 31 个与CbP5CS互作的EST序列.经酵母回转验证,31个EST序列均与CbP5CS存在互作.经NGS测序和BLAST比对搜索,获得6个转录因子基因,分别为锌指CCCH结构域蛋白 25 异构体 x1、AtbHLH104、转录因子 TFIIIC、RING/FYVE/PHD锌指超家族蛋白、GATA型锌指转录因子家族蛋白、AtbHLH96.以上结果为进一步研究植物脯氨酸代谢响应盐碱胁迫的分子机制奠定基础.