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A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立OACSTPCD

中文摘要

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。

任建乐;林铱婷;姬康;谭姗姗;陈新新;晋怡;王颖;牛胜;梁立滨;李俊平;赵宇军;田文霞;

山西农业大学动物医学学院,太谷030801北京索莱宝科技有限公司,北京101102

畜牧业

A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白原核表达多克隆抗体间接ELISA

《中国畜牧兽医》 2024 (002)

P.678-688 / 11

山西农业大学博士科研启动基金项目(2020BQ59);山西省高等学校科技创新项目(2021L145);山西省科技创新人才团队专项(202204051001022);山西省优秀博士来晋奖励基金项目(SXBYKY2021036)。

10.16431/j.cnki.1671-7236.2024.02.024

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