限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位稀有突变OACSTPCD
目的研究限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位密码子稀有突变的可行性。方法将采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测方法作为实验组,限制性内切酶酶切联合蓝白斑筛选检测方法作为对照组。对照组将KRAS基因第12位密码子突变型(MUT)/野生型(WT)(MUT/WT 12)质粒按0∶1、1∶300、1∶1000、1∶3000的比例混合,限制性内切酶酶切PCR产物,酶切后产物进行蓝白斑筛选。实验组将MUT/WT 12质粒按0∶1、1∶3000、1∶10000、1∶30000的比例混合,在对照组方法的基础上酶切产物去磷酸化后再蓝白斑筛选。比较两组蓝白斑克隆数。限制性内切酶酶切鉴定实验组MUT/WT 12为1∶30000的阳性克隆,一代测序阳性克隆验证插入片段的序列。采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选验证26例肺癌病例游离DNA的KRAS基因第12位稀有突变。结果对照组1∶3000的培养皿上白色克隆17个,蓝色克隆2329个,白色/蓝色克隆为1/137;而实验组1∶30000的培养皿上白色克隆23个,蓝色克隆394个,白色/蓝色克隆为1/17,1∶30000实验组白色/蓝色克隆比例明显高于1∶3000对照组。实验组1∶30000培养血上5个阳性克隆酶切鉴定出3个阳性,其插入片段为KRAS第12位突变片段。限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选26例肺癌病例可检测出2例为KRAS基因第12位密码子突变。结论采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选可检测出1∶30000 KRAS基因稀有突变。
周翠兰;陈婕;许云思;付乙人;彭翠英;
南华大学衡阳医学院基础医学院应用解剖学与生殖医学研究所,湖南衡阳421001 南华大学衡阳医学院生态健康与人类重要疾病防控湖南省高校重点实验室,湖南衡阳421001南华大学衡阳医学院基础医学院应用解剖学与生殖医学研究所,湖南衡阳421001 南华大学衡阳医学院生物毒理与生态修复衡阳市重点实验室,湖南衡阳421001 南华大学衡阳医学院有色金属矿区耕地重金属污染生态阻抗技术研究所衡阳市重点实验室,湖南衡阳421001
生物学
限制性内切酶酶切KRAS基因蓝白斑技术去磷酸化稀有突变
《中南医学科学杂志》 2024 (001)
P.26-30 / 5
湖南省自然基金(2020JJ4536,2021JJ30598);南华大学大学生创新课题(210XCX533,S202110555302);南华大学博士科研启动金(2018XQD12)。
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