南方红豆杉悬浮细胞超低温保存体系的建立OA北大核心CSTPCD

【目的】紫杉醇具有广谱抗癌作用,但其在红豆杉中含量极低,已无法满足日益增长的临床需求。目前,红豆杉悬浮细胞培养技术被认为是解决紫杉醇稀缺的有效途径之一,然而细胞经过连续不断传代后容易发生遗传性变异,导致细胞生长状态不佳,合成紫杉醇的能力下降。研究提出一个优化的超低温保存南方红豆杉悬浮细胞的方法以解决这一难题。【方法】以南方红豆杉悬浮细胞为材料,采用单因素试验,研究预培养温度、预培养时间、预处理剂、脱水时间、冷冻保护剂及解冻温度对细胞存活的影响,并在此基础上以细胞存活率为优化目标对超低温保存条件进行响应面优化。【结果】根据单因素试验筛选出3个显著影响因素,分别为蔗糖浓度、脱水时间、解冻温度;通过响应面优化获得细胞最佳保存条件为:南方红豆杉悬浮细胞首先在B5培养基中预培养12 d,预培养温度为5℃,然后室温下用6.6%蔗糖预处理30 min,去除预处理剂,加入20%乙二醇+35%甘油+10%DMSO+10%山梨醇作为冷冻保护剂,在0℃条件下脱水处理31 min,0℃冰浴30 min,-20℃放置2 h,最后放入-80℃冰箱中保存14 d。冷冻后的悬浮细胞在41℃水浴60 s迅速解冻,接着用含1.2 mol/L蔗糖的B5培养基洗涤去除保护剂,最后在B5培养基上对悬浮细胞进行恢复性培养。经过上述冻存处理的南方红豆杉悬浮细胞存活率可达68.19%。【结论】建立了南方红豆杉悬浮细胞的超低温保存体系,并对其进行了优化,取得了一定的冻存效果,这为南方红豆杉及其他药用植物细胞的长期维持提供了技术参考。