福建省茶树病毒种类鉴定及多重PCR检测技术的建立OA北大核心CSTPCD

【目的】明确福建省茶树主要病毒种类和分布情况,并建立同时快速检测多种病毒的多重PCR检测技术。【方法】2019—2023年,从福建省福州、南平、宁德、泉州、漳州、厦门、三明、莆田和龙岩9个地市区采集具有褪绿、皱缩和坏死等疑似病毒感染症状的茶树样品1869份,采用高通量测序技术结合PCR和RT-PCR检测的方法对茶树病毒病的病原进行鉴定,并将PCR扩增获得的特异性目的片段进行克隆和测序,对获得的序列进行系统发育分析;同时,根据GenBank上已报道的病毒序列设计特异性引物,通过退火温度、引物浓度、循环数等反应条件和反应程序的优化,建立同时检测福建茶树主要病毒的多重PCR检测技术,并测定该技术的特异性、灵敏度及实际应用效果。【结果】从所采集的茶树病样上检出3种病毒,按检出率从高到低依次为油茶双生病毒(oil tea associated geminivirus,OTaGV)(48.90%)、茶树坏死环斑病毒(tea plant necrotic ring blotch virus,TPNRBV)(26.75%)和茶树潜隐病毒1(camellia cryptic virus 1,CCV1)(17.98%);在检出病毒的1258份样品中,有807份为OTaGV、TPNRBV或CCV1单独侵染,检出率分别为37.20%、21.38%和5.56%;其余451份样品为2种或3种病毒复合侵染,复合侵染检出率达35.85%,OTaGV+CCV1、TPNRBV+CCV1、TPNRBV+OTaGV、OTaGV+CCV1+TPNRBV 4种类型复合侵染检出率分别为17.49%、0.40%、14.71%、3.26%。在地理分布上,OTaGV在福州、南平、宁德、泉州、漳州、厦门、三明、莆田和龙岩9个地区均有分布,其中漳州OTaGV检出率最高,为96.77%;CCV1在福州、南平、宁德、泉州、漳州、三明、莆田和龙岩8个地区均有分布,其中三明CCV1检出率最高,为66.00%;TPNRBV在福州、南平、宁德、泉州和漳州5个地区均有分布,其中泉州TPNRBV检出率最高,为79.13%;在福建省9个地区中,厦门地区仅检出OTaGV,三明、莆田和龙岩地区检出OTaGV和CCV1,其他5个地区同时检出OTaGV、TPNRBV和CCV1;福州、南平、宁德、泉州、漳州、三明、莆田7个地区检测到病毒复合侵染,其中漳州地区病毒复合侵染检出率最高(85.00%)、宁德地区病毒复合侵染检出率最低(23.03%)。利用测定的CCV1和TPNRBV部分基因序列构建系统发育树,结果表明本研究获得的CCV1分离物(FW)与已报道的福建分离物FJ-SH104(GenBank登录号:ON807095)亲缘关系最近、TPNRBV分离物(FU)与福建分离物QZHA92(GenBank登录号:OQ948454)亲缘关系最近。经优化建立的多重PCR检测技术特异性强,仅OTaGV、TPNRBV和CCV1能扩增出特异性目的片段,而其他病毒及健康茶树样品上均未扩增出特异性目的片段;多重PCR灵敏度最低可以检测到稀释至10^(-4)倍的OTaGV、TPNRBV和10^(-3)倍的CCV1;利用该多重PCR检测技术对茶园中采集的60份病样进行检测,检测结果与单一PCR检测结果完全相符。【结论】OTaGV、TPNRBV和CCV1是当前福建茶树上主要病毒种类,其中OTaGV为福建地区首次报道,该病毒可侵染茶树也为首次发现;在检出的3种病毒中,以OTaGV发生分布范围最广,其次为CCV1、TPNRBV;福建地区茶树病毒目前仍以单独侵染为主,但同时存在较多的复合侵染,复合侵染类型包括TPNRBV+CCV1、TPNRBV+OTaGV、CCV1+OTaGV和OTaGV+CCV1+TPNRBV;建立的多重PCR检测技术特异性强、灵敏度高,可用于茶园茶树上OTaGV、CCV1和TPNRBV3种病毒的快速检测。研究结果可为福建茶树病毒病的综合防控提供理论依据和技术支持。