miR-34a通过激活lncRNA NORHA转录诱导猪卵巢颗粒细胞早期凋亡OA北大核心CSTPCD

【目的】探索miR-34a诱导GCs凋亡的RNA激活机制,为揭示猪卵泡闭锁的分子机理、筛选调控母猪繁殖的小核酸调节物提供依据。【方法】利用生物信息学方法分析猪miR-34a特征及其与潜在靶基因lncRNA NORHA启动子的结合情况。利用核质分离技术分析猪GCs中miR-34a的亚细胞定位。qPCR检测miR-34a对猪GCs中NORHA、凋亡标志基因BCL-2和BAX表达的影响。利用荧光素酶活性分析验证miR-34a对NORHA启动子转录活性的靶向调控关系。利用染色质免疫沉淀(ChIP)检测miR-34a对猪GCs中NORHA启动子miRNA反应元件(MRE)处AGO2和组蛋白修饰因子富集情况。利用western blot和流式细胞术分析miR-34a通过NORHA对下游因子FOXO1的表达和细胞凋亡的调控作用。【结果】猪miR-34a为基因间miRNA,其序列在哺乳动物中具有高度保守性。亚细胞定位分析显示,miR-34a在猪GCs中细胞核与细胞质均有分布。生物信息学分析显示miR-34a的MRE位于NORHA启动子-194 nt至-173 nt处,且两者结合自由能为-23.9 kcal·mol^(-1)。qPCR结果表明miR-34a显著上调猪GCs中NORHA的表达。荧光素酶活性分析显示,miR-34a极显著上调NORHA启动子报告载体活性,而对MRE突变型启动子活性没有显著影响。ChIP试验显示,miR-34a可增加NORHA启动子MRE处RNA诱导转录激活(RITA)复合物核心成员AGO2和转录激活型组蛋白H3K4me3的富集,而减少转录抑制型组蛋白H3K9me3的富集。共转试验显示,敲减NORHA可显著或极显著逆转由miR-34a过表达引起的FOXO1蛋白水平和早期凋亡率的上调,以及BCL-2/BAX比值的下调。【结论】细胞核miR-34a是猪GCs中的内源性小激活RNA(saRNA),通过靶向激活促凋亡lncRNA NORHA的转录,诱导猪GCs早期凋亡(细胞膜完整),可能参与猪卵泡闭锁的启动。