N^(6)-甲基腺苷修饰及其调控蛋白在脑缺血中的表达变化及意义OA北大核心CSTPCD

目的本研究通过探讨N^(6)-甲基腺苷(N^(6)-methyladenosine,m^(6)A)修饰及其调控蛋白在脑缺血小鼠中的表达变化,为脑缺血治疗的分子靶点研究提供参考。方法取60只雄性C57BL/6J小鼠,随机分为假手术组、脑缺血1 d组、脑缺血3 d组和脑缺血7 d组,每组各15只,采用线栓法制作右侧大脑中动脉梗死模型,于缺血1 h进行拔栓再灌注。通过RNA提取及斑点印迹实验检测小鼠缺血侧脑组织RNA m^(6)A水平;使用荧光定量逆转录PCR检测小鼠缺血侧脑组织甲基转移酶3(methyltransferase 3,Mettl3)、甲基转移酶14(methyltransferase 14,Mettl14)、FTOα-酮戊二酸酯依赖性双加氧酶(FTO alpha-ketoglutarate dependent dioxygenase,Fto)、RNA去甲基化酶alkB同源基因5(alkB homolog 5,RNA demethylase;Alkbh5)、YTH N^(6)-甲基腺苷RNA结合蛋白1(YTH N^(6)-methyladenosine RNA binding protein 1,Ythdf1)、Ythdf2和Ythdf3的mRNA表达水平;利用免疫印迹实验检测缺血侧脑组织Mettl3、Mettl14、Fto、Alkbh5、Ythdf1、Ythdf2和Ythdf3蛋白的表达水平;借助免疫荧光染色观察缺血侧脑组织梗死周边区神经元中Mettl3、Fto、Ythdf1、Ythdf2和Ythdf3蛋白的表达变化情况。结果与假手术组相比,脑缺血3 d组脑组织RNA的m^(6)A水平升高(1.620±0.339 vs.1.000±0.192,P=0.0343)。(1)甲基转移酶表达情况:脑缺血7 d组Mettl3mRNA水平降低(0.675±0.059 vs.1.000±0.131,P=0.0331);脑缺血1 d组Mettl3(0.548±0.107 vs.1.000±0.056,P=0.0398)、Mettl14(0.534±0.218 vs.1.000±0.018,P=0.0108)蛋白表达水平降低;脑缺血3 d组Mettl3(0.410±0.341 vs.1.000±0.056,P=0.0084)、Mettl14(0.429±0.283 vs.1.000±0.018,P=0.0026)蛋白表达水平也均下降;免疫荧光染色显示脑缺血3 d组梗死周边区神经元中Mettl3蛋白表达减少。(2)去甲基化酶表达情况:脑缺血1 d组(0.405±0.209 vs.1.000±0.142,P=0.0108)、脑缺血3 d组(0.530±0.125 vs.1.000±0.142,P=0.0412)Fto蛋白表达水平降低;免疫荧光染色显示脑缺血3 d组梗死周边区神经元中Fto表达减少。(3)m^(6)A结合蛋白表达情况:脑缺血1 d组Ythdf1mRNA水平降低(0.708±0.046 vs.1.000±0.117,P=0.0331),Ythdf3mRNA水平升高(1.473±0.093 vs.1.000±0.142,P=0.0012);脑缺血3 d组Ythdf1(0.593±0.240 vs.1.000±0.117,P=0.0034)、Ythdf2(0.664±0.177 vs.1.000±0.200,P=0.0100)mRNA水平降低,Ythdf3 mRNA水平升高(1.451±0.281 vs.1.000±0.142,P=0.0018);脑缺血1 d组Ythdf1(0.486±0.177 vs.1.000±0.091,P=0.0197)、Ythdf3(0.536±0.107 vs.1.000±0.125,P=0.0400)蛋白表达水平降低;脑缺血3 d组Ythdf1(0.404±0.299 vs.1.000±0.091,P=0.0079)、Ythdf2(0.279±0.189 vs.1.000±0.261,P=0.0136)、Ythdf3(0.450±0.220 vs.1.000±0.125,P=0.0157)蛋白表达水平均降低;免疫荧光染色显示脑缺血3 d组梗死周边区神经元中m6A结合蛋白Ythdf1、Ythdf2、Ythdf3表达均减少。结论小鼠脑缺血后可能由Fto表达下调导致m^(6)A水平升高,Ythdf1、Ythdf2、Ythdf3蛋白表达水平趋势基本一致,可能存在功能冗余。