杨树腐烂病菌SNARE蛋白CcNyv1的功能OA北大核心CSTPCD

【目的】解析SNARE蛋白Nyv1在杨树腐烂病菌中调控囊泡运输相关过程的功能,探究该病菌在生长发育和致病过程中的作用机制,为阐明SNARE蛋白在杨树腐烂病菌致病过程中的调控机制提供理论依据,并为该病害防控提供参考。【方法】1)利用酿酒酵母Nyv1的氨基酸序列进行Blastp分析,获得其同源的CcNyv1基因;2)利用生物信息学软件对CcNyv1编码的氨基酸序列和其他真菌中的Nyv1同源序列进行多序列比对,并构建系统发育树;3)采用Split-marker方法和PEG介导的遗传转化体系,构建CcNyv1基因缺失突变体及其回补菌株;4)通过PDA平板生长试验观察菌丝生长速率,分析CcNyv1基因及其Longin、SNARE结构域对菌丝的营养生长和盐胁迫响应的影响;5)通过对1年生杨树枝条烫伤接种观察病斑扩展面积,评价CcNyv1基因及其Longin、SNARE结构域对杨树腐烂病菌致病力的影响;6)利用FM4-64染剂染色,探究CcNyv1基因和Longin、SNARE结构域对该病菌的内吞作用产生的影响。【结果】1)通过酿酒酵母Nyv1的氨基酸序列blast比对,在杨树腐烂病菌中获得其同源基因CcNyv1,该基因全长780 bp,包含1个内含子,编码1个233 aa的囊泡运输相关R-SNARE蛋白,该蛋白含有1个N端的Longin结构域和1个C端的SNARE结构域;2)多序列对比和系统发育分析表明,CcNyv1和其他子囊菌中的Nyv1同源基因具有较高的序列相似度,且在进化上较为保守,与寄生隐丛赤壳中的同源基因的亲缘关系最为接近;3)成功构建CcNyv1基因缺失突变体、Longin结构域缺失突变体、SNARE结构域缺失突变体和CcNyv1基因回补菌株;4)菌丝生长表型和侵染杨树枝条致病表型分析表明,CcNyv1基因缺失突变体和Longin、SNARE结构域缺失突变体在菌丝营养生长、盐胁迫响应以及致病力等方面存在明显缺陷;5)比较FM4-64染色后野生型和缺失突变体菌株的囊泡分布情况,可见CcNyv1基因和Longin、SNARE结构域影响杨树腐烂病菌的内吞作用。【结论】杨树腐烂病菌SNARE蛋白CcNyv1在营养生长、胁迫应答、致病力及内吞作用等方面发挥重要调控作用。