非洲猪瘟病毒P54蛋白原核表达及间接ELISA检测方法建立OA北大核心CSTPCD

【目的】建立一种具有良好特异性和敏感性的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体间接ELISA检测方法。【方法】根据ASFV P54蛋白基因序列进行大肠杆菌密码子优化,将优化后的P54序列克隆到pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET28a-P54,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的P54蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种间接ELISA方法,对包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育等反应条件进行优化后,对其临界值、特异性、灵敏性和重复性进行验证。【结果】SDS-PAGE结果显示,P54蛋白分子质量为42 ku,纯度在95%以上;Western blotting结果显示,P54蛋白与ASFV阳性血清能产生特异性反应。优化后的ELISA反应条件为:0.3125μg/mL抗原37℃包被1 h,5%脱脂奶粉37℃封闭1 h,1∶800稀释的血清37℃孵育2 h,1∶15000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h。该ELISA检测方法仅与ASFV阳性血清产生特异性反应,与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒和乙型脑炎病毒的阳性血清均无明显交叉反应;该方法灵敏性较高,ASFV阳性血清稀释度为1∶3200时仍有明显反应。批间重复和批内重复变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其阳性符合率为95.45%,阴性符合率为96.05%,总符合率为95.83%。【结论】本研究建立了一种以ASFV P54蛋白为检测抗原的ASFV间接ELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于ASFV的血清学检测,为非洲猪瘟的快速诊断提供更多选择。