丁酸梭菌对奶牛瘤胃外植体蛋白质合成的影响OA北大核心CSTPCD

本试验以丁酸梭菌为研究对象,采用瘤胃外植体进行体外研究,目的是利用分子分析和氨基酸谱分析来评估丁酸梭菌对瘤胃外植体蛋白质合成的影响。试验1:采集3头健康荷斯坦犊牛的瘤胃黏膜层组织,通过病理学观察,并检测钙黏附蛋白E(E-cadherin)的表达水平和瘤胃外植体细胞的活力,确定最佳培养时间。试验2:在瘤胃外植体培养液中分别加入200μL的3.0×10^(7)、3.0×10^(8)、3.0×10^(9)、3.0×10^(10)CFU/mL的丁酸梭菌活菌液、灭活菌液和对应的灭活菌上清液,每组设置3个重复,采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)来检测丁酸梭菌对外植体蛋白质合成通路磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)关键蛋白和基因的影响,并检测丁酸梭菌活菌培养上清液和灭活菌培养上清液中17种游离氨基酸含量的差异。结果表明:1)24 h为瘤胃外植体培养的最佳时间。2)Western blot结果显示,丁酸梭菌活菌液浓度为3.0×10^(8)CFU/mL时,磷酸化核糖体70S小亚基S6蛋白激酶(p-P70S6K)、磷酸化真核细胞起始因子4E结合蛋白1(p-4EBP1)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的蛋白表达量最高;丁酸梭菌活菌液浓度为3.0×10^(8)和3.0×10^(9)CFU/mL时,p-PI3K和p-AKT的蛋白表达量极显著高于对照组(P<0.01);磷酸化程序性细胞死亡因子4(p-PDCD4)主要抑制蛋白质合成,丁酸梭菌活菌液浓度为3.0×10^(8)和3.0×10^(9)CFU/mL时,蛋白表达量极显著低于对照组(P<0.01);p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K和p-4EBP1的蛋白表达量在丁酸梭菌灭活菌液浓度为3.0×10^(9)CFU/mL时最高,均极显著高于对照组(P<0.01)。3)Western blot结果显示,活菌组p-mTOR、p-P70S6K、p-4EBP1、p-PDCD4蛋白表达量与对照组相比有极显著差异(P<0.01);灭活菌组p-AKT、p-PDCD4蛋白表达量与对照组相比有显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01);活菌组p-P70S6K、p-4EBP1、p-PDCD4的蛋白表达量显著高于灭活菌组(P<0.05)。RT-qPCR结果显示,活菌组AKT、mTOR、PI3K、P70S6K、4EBP1和PDCD4基因相对表达量与对照组相比有极显著差异(P<0.01);灭活菌组P70S6K、AKT、mTOR、4EBP1和PDCD4的基因相对表达量与对照组相比有显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01)。4)与对照组和灭活菌培养上清液组相比,活菌培养上清液中天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)和半胱氨酸(Cys)含量差异显著(P<0.05)。与对照组和活菌培养上清液组相比,灭活菌培养上清液中的谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、蛋氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、赖氨酸(Lys)和脯氨酸(Pro)含量差异显著(P<0.05)。综上所述,对于丁酸梭菌,活菌和灭活菌均可通过改变PI3K/AKT/mTORC1通路中相关因子的表达量来促进瘤胃组织外植体中蛋白质合成。