甲氧苄啶纳米抗体噬菌体展示文库的构建及初步筛选OA北大核心CSTPCD

【目的】构建甲氧苄啶(trimethoprim,TMP)纳米抗体(nanobody,Nb)噬菌体展示文库,制备TMP高亲和力纳米抗体,为TMP免疫分析方法的建立提供新型抗体材料。【方法】通过活性酯酶法将TMP半抗原Hapten B与牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联制备2种免疫原,Hapten A和Hapten B与卵清白蛋白(OVA)偶联制备2种包被原。采用磺胺增效剂类药物单克隆抗体5C4,通过间接ELISA方法验证免疫原和包被原偶联效果。将免疫原与弗氏佐剂混合,先后对羊驼进行基础免疫和加强免疫,监测每次免疫后羊驼抗血清效价及对TMP的亲和力,选取效价及TMP亲和力最高的外周血作为纳米抗体基因来源,构建噬菌体展示文库。分离羊驼外周血总淋巴细胞,扩增重链抗体可变区纳米抗体基因(VHH),插入噬菌粒,电击转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞构建初始噬菌体纳米抗体展示文库。经辅助噬菌体救援,采用同源包被原浓度梯度递减包被、酸洗脱、TMP浓度梯度递减洗脱筛选策略筛选TMP高亲和力噬菌体并测序,原核表达纳米抗体,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定纳米抗体融合蛋白。【结果】间接ELISA检测结果显示,2种免疫原与2种包被原在稀释18000倍时D 450 nm值仍高于1.25。免疫原Hapten B-BSA 5次免疫后羊驼抗血清效价为1∶88000,对TMP的半数抑制浓度(IC 50)为12.21μg/L,但Hapten B-KLH 4次免疫后羊驼抗血清效价为1∶11000,对TMP的IC 50为30.56μg/L。以Hapten B-BSA五免后羊驼外周血为纳米抗体基因来源构建噬菌体展示文库,初始库容量为6.08×10^(7) CFU/mL,目的片段插入率为96%,噬菌体展示文库多样性良好。经4轮筛选后,获得3株TMP高亲和力噬菌体,测序分析后获得1株TMP高亲和力纳米抗体及序列。SDS-PAGE和Western blotting鉴定融合蛋白大小约为17 ku,蛋白含量80%以上。【结论】本研究成功构建TMP纳米抗体噬菌体展示文库,获得1株TMP高亲和力纳米抗体。研究结果为磺胺增效剂类药物纳米抗体的制备提供了理论依据和技术支持,为兽药等小分子新型识别材料的制备提供了新的思路。