辣椒轻斑驳病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法的建立OA北大核心CSTPCD

辣椒是重要的园艺作物,辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)严重威胁辣椒等茄科园艺作物的生产安全。为提高PMMoV的防控效率,根据其编码外壳蛋白(Coat protein,CP)的基因保守序列,基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase?aided amplification,RAA),设计了特异性RAA引物,实现对PMMoV的快速等温扩增,并基于CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物。优化结果显示,总反应体系在报告基因FQ终浓度为400 nmol/L,Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol/L和1000 nmol/L条件下检测信号最强,最终的RT-RAA反应和CRISPR显色体系分别仅需15 min,即可在便携式蓝光照射设备下直接观察到阳性信号。该方法可特异性检测PMMoV,对携带PMMoV的辣椒样品RNA的检测极限可达到1.34 pg/μL,分别是普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测灵敏度的1000倍和10倍。对实际样品中的检测结果显示,建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测技术可以在PMMoV侵染的辣椒和番茄叶片、果实及土壤中检测到PMMoV,可用于辣椒轻斑驳病毒的快速、灵敏、可视化检测。