梅病毒A新疆蟠桃分离物的全基因组序列分析与侵染性克隆构建OA北大核心CSTPCD

【目的】梅病毒A(mume virus A,MuVA)是新发现的感染桃树的病毒,其全基因组序列分析研究甚少,国内尚无报道。本研究旨在探明MuVA在我国新疆蟠桃中的感染情况,分析MuVA pp分离物的基因组、系统进化及致病性,为MuVA的防治提供科学依据。【方法】使用RT-PCR方法对田间蟠桃样品进行MuVA检测,采用5′/3′cDNA末端快速扩增(RACE)技术确定MuVA pp分离物的全基因组序列,并运用生物信息学软件分析MuVA pp分离物的基因组序列特征和系统进化关系。利用Gibson组装策略构建该分离物的基因组全长cDNA克隆,并通过农杆菌介导的方法对其侵染性进行接种测试。【结果】RT-PCR检测结果表明,30份疑似病毒病样本中有10份感染了MuVA,不同蟠桃品种感染率由高到低分别为‘七月蟠’(4/9)、‘八一蟠桃’(5/13)、‘中熟八一’(1/8);MuVA pp分离物基因组全长为7 647 nt,基因组由5′非翻译区(5′UTR)、3′UTR和两个重叠的开放阅读框(ORF)组成,编码甲基转移酶(Met)、RNA解旋酶(Hel)、RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)、外壳蛋白(CP)和运动蛋白(MP);序列分析结果显示,MuVA pp分离物与已报道的MuVA pm14分离物基因组的核苷酸和多聚蛋白氨基酸序列一致性分别为80.8%和82.7%,两者的多聚蛋白存在406个氨基酸残基的差异,分布在Met(21个)、Hel(29个)、RdRp(19个)、CP(18个)和其他(319个)。与MuVA pm14分离物显著不同的是5′UTR,核苷酸序列一致性仅为74.6%,编码的蛋白质中,MP变异最大,氨基酸一致性为80.9%,RdRp最保守,氨基酸一致性最高,为94.0%;系统发育分析结果显示,MuVA pp分离物与MuVA pm14分离物的亲缘关系最近,且MuVA有宿主和地理特异性的趋势,李子分离物与梅分离物聚集成簇,而桃分离物单独成支;构建的pCB301-MuVA侵染性克隆可以系统侵染苋色藜,并未引起症状,导致三生烟接种叶产生过敏性坏死,但不能引起系统侵染,也不能侵染昆诺藜、心叶烟、西方烟、本氏烟、番茄、黄瓜和南瓜。【结论】成功获得了蟠桃MuVA pp分离物的全基因组序列,其基因组为单链正义RNA,大小为7 647 nt,不含3′端poly(A)尾,编码两个ORF;通过摩擦接种证实MuVA不能侵染草本植物;构建了具有侵染活性的MuVA pp分离物的全长c DNA侵染性克隆载体pCB301-MuVA,可系统侵染苋色藜,且无明显症状,导致三生烟接种叶产生过敏性坏死,未引起系统侵染,这为进一步研究MuVA的致病分子机理提供了参考依据。