基于CRISPR-Cas9技术建立CSE1L基因敲除C2C12细胞OA北大核心CSTPCD

为研究染色体分离样蛋白1(chromosomesegregation 1-like,CSE1L)在小鼠骨骼肌发育中的作用,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建CSE1L基因敲除的C2C12细胞系。针对小鼠CSE1L的第3外显子设计3组sgRNA,构建sgRNA表达质粒(连接绿色荧光蛋白,green fluorescent protein,GFP)和Cas9质粒(连接红色荧光蛋白,red fluorescent protein,RFP)共转染C2C12细胞,筛选高切割效率的sgRNA;将转染该sgRNA和Cas9的C2C12细胞进行流式细胞分选,获取共表达红、绿双色荧光蛋白的细胞,并用DNA测序进行鉴定。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Western-blot)鉴定其分子特征。最后分别利用CCK-8、细胞周期以及凋亡实验对CSE1L敲除细胞系活力和凋亡进行检测。结果显示,小鼠成肌细胞中CSE1L基因mRNA和蛋白水平表达量都显著降低(P<0.01),提示CSE1L基因敲除成功。该基因缺失导致C2C12细胞变细长、细胞活力在72 h显著下调,细胞周期停滞、凋亡增加。成功构建了CSE1L基因敲除的细胞系,并研究了小鼠骨骼肌细胞生长发育相关功能,为探索CSE1L基因功能提供细胞模型,并为后续基因编辑敲除鼠制备奠定基础。