向日葵核盘菌环介导等温扩增检测技术OA北大核心CSTPCD

应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了基于颜色变化、反应灵敏的向日葵核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)检测方法。筛选出检测核盘菌的LAMP特异性引物,建立了LAMP反应体系与优化条件,并进行灵敏度和特异性试验。结果表明,以F3-1(ATGCCTGTTCGAGCGTCA)、B3-1(AGTTCAGC-GGGTATCCCTA)、FIP-1(GCCGCCACTGATTTTAGAGCCTTTTCAACCCTCAAGCTCAGC)、BIP-1(TCGTTACAG-GTTCTCGGTGTGCCCTGATCCGAGGTCAACCAT)为引物,反应体系中10×Bst Reaction Buffer 2.4μL、dNTP Mixture1.28 mmol·L^(-1)、F3/B3 0.15μmol·L^(-1)、FIP/BIP 0.8μmol·L^(-1)、HNB 150μmol·L^(-1)、MgSO_(4) 1.2 mmol·L^(-1)、Bst DNA聚合酶0.19 U·L^(-1)、ddH_(2)O 13.4μL等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,即可通过肉眼直接目测试验结果,且琼脂糖凝胶电泳验证显示清晰的梯形扩增结果。灰葡萄孢、疫霉、腐霉等其他供试菌株中均没有观察到这些现象,对核盘菌的特异性较强;LAMP技术最低检测限为1×10^(-3) ng·μL^(-1)。该方法的建立为向日葵核盘菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。