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基于二重实时荧光PCR方法精准快速鉴定大豆转基因种子转化体纯度OA北大核心CSTPCD

中文摘要

【目的】耐除草剂大豆SHZD3201、DBN9004、中黄6106(ZH10-6)相继获得生产应用安全证书,针对这3个转化体建立二重实时荧光PCR检测方法,应用于大豆转基因转化体种子纯度的精准、快速鉴定,为大豆转基因品种种子质量安全监管提供技术支撑。【方法】搜集耐除草剂大豆SHZD3201、DBN9004和中黄6106 3个转化体以及4个大豆内标准基因Lectin的实时荧光PCR方法,通过比较ΔCt值,遴选出二重实时荧光PCR的最佳大豆内标准基因检测方法;设置转化体和Lectin不同引物/探针浓度,优化二重实时荧光PCR的反应体系;根据不同类型的特异性测试样品测试二重实时荧光PCR方法的特异性;设置2 000、200、20、10、5和1拷贝的梯度样品,测试方法的检出限。利用一步提取液快速研磨单粒种子,以稀释后的粗提液直接作为模板进行二重实时荧光PCR扩增,进而开展耐除草剂大豆SHZD3201、DBN9004和中黄6106单粒种子纯度的检测。【结果】经测试计算最小ΔCt值,在SHZD3201、DBN9004和中黄6106转化体二重实时荧光PCR中,遴选出最佳大豆内标准基因Lectin检测方法。经优化,SHZD3201/Lectin二重实时荧光PCR反应体系中,SHZD3201转化体的引物/探针浓度为0.3μmol·L^(-1)/0.15μmol·L^(-1),Lectin的引物/探针浓度为0.3μmol·L^(-1)/0.15μmol·L^(-1);DBN9004/Lectin二重实时荧光PCR反应体系中,DBN9004转化体的引物/探针浓度为0.4μmol·L^(-1)/0.2μmol·L^(-1),Lectin的引物/探针浓度为0.4μmol·L^(-1)/0.2μmol·L^(-1);中黄6106/Lectin二重实时荧光PCR反应体系中,中黄6106转化体的引物/探针浓度为0.4μmol·L^(-1)/0.2μmol·L^(-1),Lectin的引物/探针浓度为0.5μmol·L^(-1)/0.25μmol·L^(-1)。3种方法特异性良好,检出限均达10个拷贝。利用100粒模拟单粒种子样本,快速研磨,模板稀释5倍后,采用二重实时荧光PCR快速扩增,成功地检测了SHZD3201、DBN9004和中黄6106种子转化体纯度。【结论】成功建立了耐除草剂大豆SHZD3201/Lectin、DBN9004/Lectin和中黄6106/Lectin的二重实时荧光PCR方法,结合一步提取液的DNA快速提取方法,实现了大豆转基因种子转化体纯度精准快速检测。

李允静;任雪贞;肖芳;晋芳;高鸿飞;景琦;武玉花;孙全;李俊;王培;翟杉杉;金石桥;吴刚;

中国农业科学院油料作物研究所/农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室/农业农村部植物生态环境安全检验测试中心(武汉)/农业农村部农业转基因生物溯源重点实验室,武汉430062全国农业技术推广服务中心,北京100125

中医学

耐除草剂大豆种子二重实时荧光PCR转化体纯度

《中国农业科学》 2024 (023)

P.4698-4711 / 14

科技创新2030—重大项目(2022ZD04019);中国农业科学院科技创新工程(CAAS-ASYIP-2021-OCRI)。

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.23.010

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