三谱系重组猪繁殖与呼吸综合征病毒株分离鉴定与基因组特征分析OA北大核心CSTPCD

【目的】通过对天津地区某疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)发病断奶仔猪肺脏组织进行病毒分离鉴定以及全基因组分子特征分析,为猪场疫病防控提供基础数据。【方法】采集发病猪肺组织检测并将PRRSV核酸阳性样品接种于猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs),采用有限稀释法纯化分离病毒,对已纯化的病毒进行间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定,利用重叠引物RT-PCR分段扩增并克隆测序获得全基因组序列,并通过生物学分析软件分别对分离毒株的核苷酸与氨基酸序列进行同源性、遗传演化与重组事件分析。【结果】成功分离1株PRRSV毒株,将其命名为N1;该毒株全基因组全长大小为15016 bp(不含polyA尾),核苷酸同源性比对分析显示与谱系8.3代表毒株JXA1全基因组同源性最高,为90.0%,与其他谱系各代表毒株的全基因组同源性为85.0%—90.0%,其中ORF2a、ORF2b、3′UTR区域同源性与谱系3(QYYZ-like)毒株最高达93.7%,与谱系1.8(NADC30-like)毒株在ORF5-ORF7区域同源性最高达96.2%,其余区域均与谱系8.3(JXA1-like)毒株有高度同源性,同时N1毒株的Nsp2区域具有与谱系1.8(NADC30-like)毒株特征一致的131(111+1+19aa)个不连续氨基酸缺失特征;GP5蛋白的预测毒力位点及主要中和抗原表位与谱系1(NADC34-like、NADC30-like)PRRSV毒株相同,但位于N^(33)、N^(44)和N^(51)的3个N-糖基化位点存在一定程度突变,这些潜在的糖基化位点突变很可能造成病毒致病力差异,并导致病毒免疫逃逸发生;根据ORF5及全基因组序列构建的遗传进化树基因分型显示,基于N1毒株ORF5基因遗传进化树与谱系1.8(NADC30-like)毒株亲缘较近,处于同一分支,但基于N1毒株全基因组遗传进化树与谱系8.3(JXA1-like)毒株处于同一分支,提示该毒株存在重组可能性;通过Simplot和RDP4.0等多种生物信息学软件的重组分析显示,该毒株是1株以谱系8.3(JXA1-like)为亲本毒株,谱系1.8(NADC30-like)和谱系3(QYYZ-like)为次本毒株的多谱系重组毒株,共存在13个重组事件,其中主要亲本毒株JXA1-like与NADC30-like毒株和QYYZ-like毒株可能分别在A(1—421 nt)、B(422—1735 nt)、C(1736—3598 nt)、D(3599—4439 nt)、E(4440—5762 nt)、F(5763—6451 nt)、G(6502—7226 nt)、H(7227—8295 nt)、I(8296—9312 nt)、J(9313—11536 nt)、K(11537—12854 nt)、L(12855—13859 nt)、M(13860—15016 nt)处发生了重组,重组断点位于基因组的Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp7、Nsp9、Nsp12、ORF3和ORF5中。【结论】试验分离鉴定的PRRSV N1毒株是一株以谱系8.3(JXA1-like)毒株为主要亲本的PRRSV三谱系重组毒株,且存在广泛的、复杂的重组现象,即谱系1.8、谱系3、谱系8.3三个谱系重组,可为天津地区的猪繁殖与呼吸综合征综合防控提供参考。