柑橘大实蝇Bmin Minus OBP1和Bmin Plus OBP1的克隆、原核表达及其配体结合特性OA北大核心CSTPCD

【目的】分析柑橘大实蝇Minus-C OBP(BminMinusOBP1)和Plus-C OBP(BminPlusOBP1)的分子特征及其异源表达蛋白的配体结合特性,为揭示非Classic OBP在柑橘大实蝇嗅觉识别中的作用提供参考。【方法】基于实验室前期构建的柑橘大实蝇转录组数据,分析、鉴定和克隆BminMinusOBP1和BminPlusOBP1;利用生物信息学软件和RT-qPCR技术分别对BminMinusOBP1和BminPlusOBP1的序列特征和组织表达模式进行分析;构建重组表达载体pET32a/BminMinusOBP1和pET32a/BminPlusOBP1,将重组表达载体转入原核细胞BL21(DE3)中进行异源表达;以1-NPN为荧光探针通过竞争结合实验检测细菌表达的BminMinusOBP1和BminPlusOBP1蛋白对12种寄主植物挥发物组分的结合能力。【结果】序列分析表明,BminMinusOBP1开放阅读框全长426 bp,编码141个氨基酸残基,在其氨基端有一段16个氨基酸残基组成的信号肽。其成熟蛋白预测分子量为14.39 kDa,等电点为4.86。序列中存在Minus-C OBP典型特征,即4个保守半胱氨酸残基。BminPlusOBP1开放阅读框为765 bp,编码254个氨基酸残基,其氨基端的18个氨基酸残基为信号肽序列。其成熟蛋白预测分子量为27.29 kDa,等电点为5.75。序列中包含Plus-C OBP特有的保守半胱氨酸残基和脯氨酸残基。组织表达模式结果显示,BminMinusOBP1和BminPlusOBP1在主要嗅觉器官触角中的表达量并不高,而在去除触角的头部组织中表达量较高。荧光竞争结合实验显示,BminMinusOBP1和BminPlusOBP1均表现出较宽的配体结合谱。BminMinusOBP1可以结合供试12种气味中的8种,分别为丁香酚甲醚、芳樟醇、乙偶姻、α-蒎烯、水杨酸甲酯、苯甲醛、1-辛醇和柠檬醛,Ki值介于9.02—22.13μmol·L^(-1);BminPlusOBP1可结合供试的全部12种气味配体,Ki值介于7.40—16.74μmol·L^(-1)。【结论】BminMinusOBP1对芳樟醇、乙偶姻、柠檬醛等7种寄主植物挥发物组分表现出中、高强度的亲和力;BminPlusOBP1对丁香酚甲醚、覆盆子酮、苯乙酸甲酯等12种寄主植物挥发物组分表现出中、高强度的亲和力。这些信息可为全面了解柑橘大实蝇气味结合蛋白家族各成员的功能特征提供重要参考。