大豆抗花叶病毒病基因GmRHF1的克隆及功能分析OA北大核心CSTPCD

【目的】大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)引起的大豆花叶病毒病严重制约着大豆的产量和品质,通过序列变异分析、病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)等技术验证了大豆RING-H2型锌指蛋白基因GmRHF1的抗病功能,利用酵母双杂交试验和荧光素酶互补试验筛选并验证其互作蛋白,为深入探究GmRHF1的抗SMV作用机制奠定基础。【方法】首先,从大豆品种徐豆14(高抗SMV)和石山黑豆(高感SMV)中分别克隆GmRHF1,并在代表性抗、感种质资源中分析序列变异的一致性,挖掘基因抗病优异变异。其次,利用荧光定量PCR分析基因在不同组织的表达量差异及SMV处理下基因的表达量变化趋势;同时,采用病毒诱导的基因瞬时沉默技术验证GmRHF1的抗SMV功能。通过酵母cDNA文库筛选、酵母对点验证和荧光素酶互补试验筛选并验证GmRHF1的互作蛋白。最后,利用病毒诱导的基因瞬时沉默技术验证GmClpP6的抗SMV功能,明确GmRHF1与GmClpP6互作对大豆抗SMV的生物学意义。【结果】GmRHF1具有E3泛素蛋白连接酶家族RING-H2型保守结构域,属于典型的RING-H2 finger家族成员。序列变异分析发现GmRHF1具有一个自然存在的非同义突变,可能与SMV抗感性相关。荧光定量PCR显示,病毒诱导后,GmRHF1在抗病材料中的表达量水平显著高于感病大豆。病毒诱导的基因沉默试验显示,有效沉默GmRHF1大豆的叶片降低了大豆对SMV的抗病性,说明GmRHF1具有抗SMV功能。通过酵母cDNA文库,筛选到30个GmRHF1的潜在互作蛋白,利用酵母对点验证和荧光素酶互补试验,证实GmRHF1与GmClpP6间的互作关系。同时,病毒诱导的基因瞬时沉默试验表明,在有效沉默GmClpP6的植株叶片中,大豆对SMV的抗病性减弱。【结论】大豆GmRHF1在编码区序列中存在的非同义突变可能与SMV抗感性相关;GmRHF1可与GmClpP6发生相互作用。GmRHF1在SMV抗性反应中具有重要作用。