质粒CRISPR/Cas9系统在马口鱼精原干细胞系基因编辑中的应用OA北大核心CSTPCD

【目的】检测质粒CRISPR/Cas9系统在马口鱼精原干细胞(ObSSCs)和斑马鱼胚胎中的基因编辑效果,为开展基因编辑的SSCs移植提供技术支撑,进而推动养殖鱼类基因编辑育种工作的快速发展。【方法】将靶向红色荧光蛋白(RFP)的gRNA整合至可用于体内外基因编辑的整合质粒pCas9-zU6sgRNA(带有支架序列的向导RNA,由来自斑马鱼的U6启动子驱动)和报告质粒pCVpf-gRNA(向导RNA)中,然后分别转染ObSSCs和显微注射斑马鱼胚胎,通过荧光显微镜观察和PCR检测质粒CRISPR/Cas9系统在ObSSCs及斑马鱼胚胎中的基因编辑效果。【结果】以整合质粒pCas9-zU6sgRNA与报告质粒pCVpf-gRNA共转染正常ObSSCs及pCVpr质粒转染ObSSCs,在ObSSCs中能观察到绿色荧光,且在表达绿色荧光蛋白(GFP)的ObSSCs中观察到红色荧光信号明显减弱,而不转染质粒的ObSSCs未观察到绿色荧光信号;随着整合质粒pCas9-zU6sgRNA转染剂量由340 ng增加到410 ng,其基因编辑效率由0.10%增加到0.63%;此外,质粒CRISPR/Cas9系统在基因组中的编辑效率与在外源质粒中的编辑效率基本一致。为进一步检测质粒CRISPR/Cas9系统在体内的编辑效率,以整合质粒pCas9-zU6sgRNA与报告质粒pCVpf-gRNA共注射斑马鱼胚胎,24h后能观察到绿色荧光信号,而空白对照组和阴性对照组斑马鱼胚胎均未观察到绿色荧光信号。对ObSSCs和斑马鱼的基因编辑效果进行PCR验证,发现试验组均能检测到修复的GFP片段,而空白对照组未检测到修复的GFP片段。此外,整合质粒pCas9-zU6sgRNA在斑马鱼胚胎中的基因编辑效率显著高于ObSSCs(100%vs 0.63%)(P<0.05)。【结论】由整合质粒p Cas9-zU6sgRNA与报告质粒pCVpf-gRNA构成的质粒CRISPR/Cas9系统能在ObSSCs中直观评估基因编辑效率,且质粒CRISPR/Cas9系统在同为鲤科鱼类斑马鱼胚胎中的基因编辑效率高达100%。因此,质粒CRISPR/Cas9系统可用于马口鱼和斑马鱼的sgRNA筛选,为创制养殖鱼类新品种(系)提供新思路。