温石棉染毒肺上皮细胞的miRNA表达谱分析OA北大核心CSTPCD

[背景]温石棉被广泛应用于建筑、工业等领域。研究显示其易导致职业人群肺纤维化,但微小RNA(miRNA)参与温石棉致肺纤维化的研究较少,具体机制尚不明确。[目的]采用二代测序技术分析温石棉染毒对人肺上皮细胞(BEAS-2B细胞)miRNA表达谱的影响,探讨差异表达的miRNA及相关信号通路的变化,寻找温石棉诱导肺纤维化的潜在靶点及分子机制。[方法]本研究用激光粒度分析仪和X射线衍射仪对温石棉进行了粒径大小和物相分析,并对BEAS-2B细胞进行不同时间(12、24和48 h)、不同剂量(0、50、100和200μg·mL^(-1))的温石棉染毒。用细胞活力检测试剂盒(CCK8)检测细胞存活率。通过蛋白免疫印迹(WB)检测200μg·mL^(-1)温石棉染毒BEAS-2B细胞24 h后纤维连接蛋白(Fibronectin)、胶原蛋白Ⅰ(Collagen-Ⅰ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平。二代测序技术分析温石棉染毒后与对照组的样本相关性和miRNA表达谱的变化。预测差异miRNA的靶基因并对其进行基因功能注释(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。[结果]本研究所用温石棉粉尘平均粒径为3.58μm,X射线衍射分析结果均为温石棉特征峰。与对照组比较,温石棉随浓度和染毒时间的增加而逐渐抑制BEAS-2B细胞存活率(P<0.01)。50、100和200μg·mL^(-1)温石棉染毒细胞12 h后的存活率分别为83.88%±1.86%、78.07%±3.97%、71.95%±2.99%;染毒24 h后的存活率分别为77.41%±1.58%、69.57%±2.23%、62.79%±3.65%;染毒48 h后的存活率分别为74.31%±4.93%、65.84%±2.71%、52.74%±6.31%。200μg·mL^(-1)温石棉染毒BEAS-2B细胞后Fibronectin、Collagen-Ⅰ和α-SMA蛋白表达水平升高(P<0.05)。温石棉实验组和对照组主成分分析显示两组样本成分存在差异,共筛选出163个差异miRNA,其中上调79个,下调84个。GO分析显示差异miRNA主要与RNA聚合酶Ⅱ的转录调控、DNA模板转录调控、细胞分化、蛋白磷酸化、脂质代谢和细胞周期等生物学过程,细胞核、细胞膜、细胞骨架、线粒体和内质网等细胞组分以及蛋白结合、金属离子结合、转移酶活性和DNA结合等分子功能有关;KEGG分析显示差异miRNA的靶基因主要富集于癌症通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路、Ras相关蛋白1(Rap1)通路、钙离子通路、环磷酸鸟苷/蛋白激酶(cGMP/PKG)通路、Hippo通路、环磷腺苷(cAMP)通路和Ras通路等。[结论]温石棉染毒会抑制BEAS-2B细胞存活率,使肺纤维化相关蛋白表达升高,诱导miRNA差异表达,影响脂质代谢、蛋白磷酸化、细胞周期等生物学过程和线粒体、内质网等细胞组分,干扰PI3K/AKT通路、Hippo通路、cAMP通路、Rap1通路和Ras通路等。