雌激素受体α激活腺苷酸活化蛋白激酶信号通路促进成骨细胞的增殖与分化OA北大核心

背景:研究表明,雌激素受体α可作为上游蛋白,调节腺苷酸活化蛋白激酶的表达及磷酸化水平,激活雌激素受体α-腺苷酸活化蛋白激酶通路可促进成骨增殖分化。目的:通过成骨细胞系、分子生物学层面探讨雌激素受体α调控腺苷酸活化蛋白激酶的分子机制及对成骨细胞增殖、分化的影响。方法:(1)将传代的MC3T3-E1小鼠胚胎成骨细胞分3组:空白对照组、mock组(转染pCDNA3.1对照质粒)、雌激素受体α组(转染pCDNA3.1-雌激素受体α过表达质粒),RT-qPCR和Western blot法检测肝激酶B1、CaMKKβ和腺苷酸活化蛋白激酶α1 mRNA、蛋白及磷酸化水平。(2)ChIP-qPCR证明雌激素受体α与肝激酶B1启动子互作;双荧光素酶实验证明雌激素受体α与肝激酶B1启动子区域互作激活其转录表达。(3)细胞分3组:mock+shNC组、雌激素受体α+shNC组、雌激素受体α+shLKB1组,采用Western blot检测细胞中肝激酶B1、磷酸化肝激酶B1、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α1蛋白的表达水平变化。(4)细胞分4组:mock组、雌激素受体α组、雌激素受体α+5μmol/L Compound C(腺苷酸活化蛋白激酶抑制剂)组、雌激素受体α+10μmol/L Compound C组,Western blot法检测腺苷酸活化蛋白激酶信号通路相关蛋白和成骨分化相关蛋白的表达。细胞转染24 h后给予成骨诱导14 d,检测各组细胞碱性磷酸酶染色及活性情况。成骨诱导21d采用茜素红染色检测矿化结节形成情况。(5)按分组转染及不同浓度腺苷酸活化蛋白激酶抑制剂预处理,通过CCK8检测细胞活力。结果与结论:(1)雌激素受体α能激活MC3T3-E1细胞中腺苷酸活化蛋白激酶信号通路;(2)雌激素受体α可促进肝激酶B1转录介导腺苷酸活化蛋白激酶信号通路激活;(3)雌激素受体α通过激活腺苷酸活化蛋白激酶信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖分化,腺苷酸活化蛋白激酶抑制剂干预下腺苷酸活化蛋白激酶α1、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α、骨保护素、骨桥蛋白、Runx2蛋白表达下调,成骨细胞活力下降;(4)结果说明,雌激素受体α可通过肝激酶B1启动子激活腺苷酸活化蛋白激酶通路,促进成骨细胞增殖和成骨分化,起到防治骨质疏松症的作用。