通窍活血汤含药血清对星形胶质细胞谷氨酸代谢的影响OA

目的:观察通窍活血汤(THD)对星形胶质细胞(AS)氧糖剥夺/复氧(OGD/R)的影响,并从AS影响谷氨酸(Glu)的代谢角度对其作用机制进行探讨。方法:提取胎鼠原代AS并鉴定其纯度,2-(2-甲氧基-4硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(CCK-8)法筛选ASOGD/R的最佳造模时间以及THD含药血清对AS存活率、毒性的影响,THD含药血清抗ASOGD/R的最佳治疗浓度,然后将AS随机分为正常细胞(Control)组、OGD/R组、通窍活血汤含药血清(THD)组、20S蛋白酶体抑制剂(MG132)组、20S蛋白酶体抑制剂+通窍活血汤含药血清(MG132+THD)组、二甲基亚砜(DMSO)组。比色法检测AS内Glu、谷氨酰胺(Gln)浓度;免疫荧光化学染色、蛋白质印迹(Westernblotting)法检测AS内谷氨酰胺合成酶(GS)、20S蛋白酶体(20S)的荧光强度及蛋白表达量。结果:免疫荧光化学染色结果显示,AS阳性数量在90%以上。根据在不同条件下CCK-8法检测的AS情况,选定细胞存活率接近50%的氧糖剥夺6 h/复氧24 h(OGD6 h/R24 h)为最佳造模时间。根据不同浓度含药血清对OGD/R后AS活力影响的CCK-8检测结果,选定无毒性且药效最佳的5%含药血清为THD治疗浓度。与Control组比较,OGD6 h/R24 h后AS内Glu、Gln浓度明显降低(P<0.01);与OGD6 h/R24 h组比较,THD组、MG132组和MG132+THD组的Glu、Gln浓度均明显升高(P<0.05或P<0.01)。免疫荧光结果显示,与Control组比较,OGD6 h/R24 h后AS中GS的荧光强度明显降低(P<0.01),20S的荧光强度升高(P<0.05);与OGD6 h/R24 h组比较,THD组、MG132组和MG132+THD组GS的荧光强度均明显升高(P<0.01),20S的荧光强度降低(P<0.05或P<0.01)。Westernblotting结果显示,与Control组比较,OGD6 h/R24 h后AS中GS蛋白表达量降低(P<0.05),20S蛋白表达量明显升高(P<0.01);与OGD6 h/R24 h组比较,THD组、MG132组和MG132+THD组GS蛋白表达量明显升高(P<0.01),20S蛋白表达量降低(P<0.05或P<0.01)。结论:ASOGD/R后20S对GS的降解增多,Clu代谢受阻。THD可抑制20S对GS的降解,提高GS的表达,促进AS内Glu代谢,发挥脑保护作用。