柑橘木虱黏液样蛋白DcMucin-like抗体制备及应用OA北大核心

【目的】黏液样蛋白(mucin-like protein)参与半翅目昆虫取食过程中唾液鞘的形成。本研究旨在制备柑橘木虱(Diaphorina citri)黏液样蛋白DcMucin-like特异性抗体并对木虱取食孔进行免疫荧光标记,为DcMucin-like生物学功能研究提供依据。【方法】通过解剖柑橘木虱唾液腺、中肠、卵巢和精巢组织,根据木虱DcMcuin-like序列设计特异性引物,利用实时荧光定量PCR检测分析各组织中DcMcuin-like在转录水平的差异;扩增无信号肽的DcMucin-like序列并插入pET-28a中构建重组质粒,测序验证后转化Rosetta表达菌株,以终浓度0.5 mmol·L-1 IPTG在37℃下振荡培养8 h诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE凝胶电泳检测重组蛋白表达情况;扩大培养后裂解菌体,裂解液上清经Ni-NTA纯化作为抗原免疫家兔5次,纯化血清IgG获得DcMucin-like多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性;利用实时荧光定量PCR和Western blot比较健康木虱和感染黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)木虱中DcMucin-like在转录水平和蛋白水平的差异;利用交联荧光素(FITC)的DcMucin-like多克隆抗体标记木虱取食后的柑橘叶片,在共聚焦显微镜下观察柑橘木虱取食孔和唾液鞘。【结果】实时荧光定量PCR检测显示DcMcuin-like在木虱唾液腺中大量表达,且表达量显著高于中肠、卵巢和精巢组织。携带有pET28a-DcMucin的Rosetta表达菌株经IPTG诱导后在菌体裂解液的上清中获得大量表达的重组蛋白。重组蛋白免疫家兔后取抗血清纯化IgG,Western blot结果表明获得特异性好的DcMucin-like多克隆抗体。实时荧光定量PCR和Western blot分析结果显示DcMucin-like在木虱响应黄龙病菌侵染时上调表达。DcMucin-like(FITC)荧光抗体标记木虱取食后的柑橘叶片组织切片,共聚焦显微镜下观察到木虱的取食孔,并在取食孔周围检测到特异的FITC荧光信号,表明DcMucin-like随木虱取食释放到植株组织中参与唾液鞘形成。【结论】DcMucin-like在柑橘木虱唾液腺中高表达并响应黄龙病菌侵染上调表达;成功制备了特异性好的柑橘木虱DcMucin-like多克隆抗体;验证了DcMucin-like随木虱取食分泌到柑橘植株组织中。研究结果可为深入探究DcMucin-like在黄龙病菌-木虱-柑橘三者互作中的作用打下基础。