葡萄自噬基因ATG8f的克隆及其功能分析OA北大核心

【目的】通过对葡萄自噬基因ATG8f的克隆与功能分析,探讨其在植物铜胁迫耐受调控中的作用,为植物耐铜机制解析与调控网络构建奠定基础。【方法】基于本课题组铜胁迫下‘阳光玫瑰’葡萄多组学测序分析结果,筛选获得细胞自噬基因VlATG8f,并分析其序列特征,克隆CDS序列,构建VlATG8f过表达载体。通过烟草瞬时表达试验研究VlATG8f蛋白的亚细胞定位,利用花序浸染法使其在拟南芥中异源表达,观察和测定野生型和转基因株系的种子发芽率及根长,比较其在铜胁迫处理下的生长发育状况。利用实时荧光定量PCR技术分析相关抗氧化基因的表达水平,并采用酵母双杂交技术和双分子荧光互补试验初步筛选VlATG8f的互作蛋白。【结果】‘阳光玫瑰’ATG8f的CDS为393bp,编码130个氨基酸。生物学信息分析发现,拟南芥、番茄、苹果、白梨、桃和葡萄ATG8f的蛋白序列较为保守,都含有一个Ubl_ATG8保守结构域,可能具有相似的功能。亚细胞定位发现,VlATG8f蛋白定位于细胞核和细胞膜。正常条件下,野生型和过表达VlATG8f株系生长状态良好,叶片青翠,但在铜胁迫下株系矮小,甚至出现了黄化、叶片卷曲、根毛细短和侧根增多的现象。但与野生型相比,过表达VlATG8f的拟南芥幼苗在铜处理后生长受限较小,种子发芽率和根长受抑制作用较轻,过氧化氢(H_(2)O_(2))积累较低,表明VlATG8f的过表达增强了转基因株系对铜的耐受性。此外,VlATG8f过表达植株在铜胁迫下抗氧化基因AtCSD1和AtCCS1表达量增加,参与ROS合成的关键基因RbohB表达量降低,促进了对ROS的清除。通过酵母双杂交技术筛选到23个与VlATG8f可能互作的蛋白。BiFC进一步验证发现PYL8、MnSOD、AUX22D、bZIP17和COT44与VlATG8f之间存在较强的互作。【结论】过表达VlATG8f可能通过增强抗氧化系统能力、降低ROS合成和促进植物激素合成等途径,提高转基因株系的耐铜性,减轻铜毒性对植物的伤害。