钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ质粒的构建和表达及其与Ca_(V)1.2通道结合的鉴定OA北大核心
目的构建钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)长片段的融合蛋白质粒,表达、提取、纯化,并鉴定其与Ca_(V)1.2通道蛋白的结合。方法将提取的pGEX-6p-1/CaMKⅡ长片段质粒转化到原核大肠杆菌BL21感受态细胞,摇床培养箱中培养12 h,添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,促进GST融合蛋白的表达。采用DTT联合超声破碎法,谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B(GS-4B)分离、纯化GST-CaMKⅡ长片段后,经过PreScission蛋白酶处理,切除GST标签,得到CaMKⅡ长片段蛋白。采用15%SDS-PAGE鉴定CaMKⅡ长片段蛋白的分子量和相对纯度;采用Bradford方法测定纯化后蛋白的浓度;采用pull-down结合Western blotting鉴定其与Ca_(V)1.2通道蛋白的结合能力。结果测序结果表明,CaMKⅡ长片段构建成功。通过DTT联合超声破碎法,得到了较高纯度和浓度的长片段CaMKⅡ蛋白,并能够与心肌Ca_(V)1.2钙通道末端CT1蛋白结合。结论本研究成功构建了CaMKⅡ长片段钙调蛋白激酶融合蛋白质粒,提取、纯化了能够与Ca_(V)1.2通道蛋白结合并具有生物活性的CaMKⅡ长片段蛋白,为深入研究CaMKⅡ蛋白的功能奠定了基础。
王红梅;王祥卉;张文竹;何蕊;廖天佐;高青华;郝丽英
中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳110122 赤峰市医院药剂科,内蒙古赤峰024000中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳110122中国医科大学继续教育学院综合办公室,沈阳110001中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳110122中国医科大学生命科学学院发育细胞生物学教研室,沈阳110122中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳110122 中国医科大学生命科学学院发育细胞生物学教研室,沈阳110122中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳110122
药学
钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ质粒构建分离纯化pull-down
《中国医科大学学报》 2025 (1)
P.1-4,11,5
国家自然科学基金(32271160)辽宁省科学技术计划(2022JH2/20200069)赤峰市自然科学基金(SZR24098)中国医科大学大学生创新创业训练计划(S202410159081)。
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